INSTITUTO TECNOLOGICO EL LLANO AGUASCALIENTES
CARRERA:
ING. EN INNOVACIÒN AGRÌCOLA SUSTENTABLE
MATERIA:
MICROBIOLOGÌA.
PRACTICAS:
*TINCIÒN GRAM*
GRADO Y GRUPO:
IV º “A”
DOCENTE TITULAR DE LA MATERIA:
M.C. ROSA DEL CARMEN BEAS.
ALUMNO:Victo esparza Díaz
En los pasados días los alumnos del grupo de IV semestre de Ingeniería en Innovación Agrícola Sustentable del Instituto Tecnológico el Llano Aguascalientes llevaron a cabo varias practicas realizadas bajo la supervisión y asesoría de la M.C. Rosa del Carmen Beas; se espera que la información aquí presente sea de gran utilidad para todo lector que se enfrente con ella y de igual manera se aceptan críticas constructivas para el mejor uso, desempeño, practica y elaboración de estas, adelante…………….
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogodanésChristian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Bacterias Escherichiacoli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.
BacteriasClostridium perfringens (Gram positivas).
Metodología
Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Enjuagar con etanol. Enjuagar con agua. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua.Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:
El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en medio alcalino. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en el “punto isoeléctrico”. Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
- Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
- Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
- Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
- Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
- En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
- Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
- La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
- El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.
Gianni (1952) comprobó que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reacción. Otra explicación de la reacción de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un núcleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacción grampositiva depende de que se forme una combinación compleja entre los componentes de la coloración de Gram y las proteínas de la pared celular, sería de esperar que las bacterias desintegradas por medios físicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podría cambiar el carácter químico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los gérmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusión celular exenta de proteínas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinión de que la reacción grampositiva consiste esencialmente en la formación, dentro de la célula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difícil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos después de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin dificultad el complejo formado después del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las proteínas básicas han influido específicamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.
Técnica de la coloración gram
Fijar un frotis
- Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
- Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.
- Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
- Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.
- Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Tinción
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.
Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1%
Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias.
Decoloración
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul.
Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
Tinción de contraste
Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.
Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.
Bacterias resistentes a la tinción Gram
La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas:
- Mycobacterias (están encapsuladas).
- Mycoplasmas (no tienen pared).
- Formas L (pérdida ocasional de la pared).
- Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).
Utilidades
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
- Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.
También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.
Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
Causas que alteran la tinción de Gram
- I: Edad de la bacteria.
- II: Errores del operador.
- III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica empleada, por ella junto a la muestra deben teñirse controles con grampositivas y gramnegativas.
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